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　　人工智能（AI）驱动实时数字微电机追踪的超灵敏免疫分析新策略：单分子结合驱动运动实现数字化蛋白检测

　　本文提出了一种创新的人工智能辅助实时数字微电机追踪免疫分析（AI-dMIA）。该方法摒弃了传统数字生物检测所需的复杂微室制造与荧光信号系统，通过追踪单个分子结合事件引发的微电机独特运动轨迹，实现了超灵敏（飞克/毫升级）蛋白质生物标志物的数字式实时分析。其开发的多微粒追踪系统（MTS）可同时大规模追踪数千个运动轨迹，展现了在疾病早期诊断领域的巨大应用潜力。

　　数字生物分析技术因其单分子水平的检测能力，已成为疾病早期诊断领域的关键技术。然而，传统的数字分析方法（如Simoa和ddPCR）依赖于精密的密封微室制造、复杂的终点荧光信号读取以及高端设备，限制了其在中心实验室以外的广泛应用。此外，基于微珠的非密封数字策略也严重依赖终点荧光检测，需要酶催化或核酸信号放大反应来确保单个靶分子产生足够强的荧光信号，且成像时信号易丢失，影响检测效率。

　　与此不同，本文提出了一种新型的人工智能（AI）辅助实时数字微电机追踪免疫分析（AI-dMIA）。该方法以蛋白质生物标志物为模型分析物，利用自主开发的多微粒追踪系统（MTS）实时监测微电机的运动轨迹，从而实现数字化的蛋白质分析。在这一设计中，即使是在完全开放的微粒表面发生单个分子桥联的免疫结合事件，也能诱导产生明显的运动行为和轨迹，形成一个可被明场显微镜结合AI算法实时准确追踪并与阴性微粒区分的阳性微电机。

　　该设计以磁驱动为例。首先，用捕获抗体功能化的聚苯乙烯微球（直径6 μm，记为PS

　　会与生物素标记的检测抗体发生夹心免疫反应。随后，引入链霉亲和素-多聚HRP（SA-polyHRP），通过酪酰胺信号放大（TSA）在携带目标蛋白的PS

　　上催化沉积大量生物素-酪胺，从而捕获大量的SA标记的磁性纳米粒子（直径50 nm，记为MNPs

　　的运动轨迹可通过普通明场显微镜记录，并使用MTS进行大规模实时轨迹跟踪分析。因此，由单个分子免疫反应诱导的PS

　　会沿磁场方向表现出明显运动，从而被MTS识别为阳性电机；而仅显示不规则布朗运动的MNPs

　　准确、实时的微电机追踪是AI-dMIA概念的基础。自主编写的MTS系统将多微粒识别和轨迹追踪整合到一个一体化工作流中，能够很好地应对大规模同时追踪数千个轨迹的挑战。其算法框架具体包括：通过切片辅助超推理（SAHI）将运动视频分割成大量重叠的图像块，并结合YOLOv11进行目标识别。随后使用Otsu自适应阈值分割量化目标像素覆盖率，并基于单个PS

　　的数量，从而实现精确计数。之后，简单的在线实时追踪（SORT）算法处理连续帧的识别结果以实现跨帧关联，从而支持数千个目标的实时、大规模轨迹追踪。最后，通过设定阈值获得阳性电机数量、阳性电机百分比（PPM）以及仅包含阳性电机的轨迹标记视频。

　　识别和阳性电机的轨迹长度。

　　经过训练，YOLOv11模型显示出高识别精度，平均精度达到97.76%。MTS的追踪有效性通过测试完整视频序列得到验证，达到了92.72%的多目标追踪准确度（MOTA）。与ImageJ相比，MTS在单PS

　　分辨计数识别方面表现出更优的能力，因为它可以自动将聚集体分割为单个PS

　　进行计数并分别追踪其轨迹。在实际工作流程中，随着时间的推移，阳性电机沿磁场方向的轨迹逐渐变长。这些结果表明，自主编写的MTS具有优异的识别和追踪精度。

　　以前列腺特异性抗原（PSA）作为模型生物标志物，评估了AI-dMIA的可行性和分析性能。首先，通过分析纯PS

　　沿期望方向的运动速度大于设定阈值时，被识别为阳性电机（1）；反之则为阴性（0）。此设置可确保几乎所有纯PS

　　而不添加PSA（空白）时，仅检测到可忽略不计的阳性电机，这归因于抗体对之间不可避免的弱非特异性吸附。然而，当向AI-dMIA系统中加入200 fg/mL PSA时，显著的阳性电机展现出明显的运动行为和轨迹，可以与阴性电机清晰区分，证明了所提出AI-dMIA的可行性。

　　6（a）、以及添加了0（空白，b）和200 fg/mL（c）PSA的传感系统。

　　在最优条件下，通过检测一系列稀释的PSA来研究AI-dMIA的分析性能。随着PSA浓度从10 fg/mL上升到3 pg/mL，阳性电机数量和PPM逐渐增加。低至10 fg/mL的PSA可以与空白对照清晰区分。通过绘制PPM与PSA浓度（0.01至3 pg/mL）之间的关系，获得了极佳的线性曲线，回归方程为

　　为0.9990。该方法的重复性通过在不同日期测试400 fg/mL PSA进行评估，显示出优异性能。

　　此外，该方法还扩展到量化肝细胞生物标志物甲胎蛋白（AFP）和阿尔茨海默病相关蛋白Tau，以研究其普适性。与PSA分析类似，设定相同的阈值来区分阳性和阴性电机。随着AFP和Tau浓度升高（AFP为0.04–8 pg/mL，Tau为0.01–6 pg/mL），阳性电机数量和PPM稳步上升，AFP和Tau的最低测定剂量分别为40 fg/mL和10 fg/mL，表明该方法具有优异的普适性。通过选择几种潜在的干扰蛋白来评估所提出AI-dMIA的特异性。结果显示，只有添加了PSA的样品能表现出沿磁场方向的明显运动。由AFP、癌胚抗原（CEA）、Tau和心肌肌钙蛋白I（cTnI）产生的PPM均可忽略不计，表明该方法具有高特异性。同型对照抗体的验证结果也支持这一结论。通过测试26份临床血清样本（15份来自前列腺癌患者，11份来自健康个体）探索了该方法的实用性。AI-dMIA结果显示，癌症患者的PSA水平明显高于健康个体，与医院结果一致，表明该策略在真实复杂样本中监测目标蛋白方面具有巨大潜力。

　　目前，现有的数字免疫分析主要采用终点检测模式，在整个信号生成/放大反应过程完成后静态计数阳性/阴性实体。为了证明实时数字信号方式的优越性，研究尝试通过终点磁分离分析相同的反应系统。结果表明，通过磁分离方式，4 pg/mL PSA诱导的PS

　　数量才勉强能与空白对照区分，远高于AI实时数字信号方式（10 fg/mL）。这是因为在低丰度PSA下，每个PS

　　，导致磁力不足以抵抗磁分离和洗涤。研究还设计了一种使用双槽连接芯片的终点计数策略，但由于液流干扰，同样无法通过简单计数反映实际目标蛋白浓度。相比之下，AI-dMIA避免了磁分离和纯化步骤，能够精确区分即使由一个单分子免疫结合事件形成的PS

　　的明场图像。(c) 使用双槽连接芯片进行PSA分析的终点检测模式。(d) 不同PSA浓度（0, 40, 100, 400, 和 1000 fg/mL）驱动的右槽中PS

　　的明场图像。(e-h) TSA在AI-dMIA中的关键作用。(e) 使用PS

　　在AI实时数字信号方式下进行无TSA的一步免疫测定。(f) (e)中不同PSA剂量诱导的阳性电机数量。(g) 使用PS

　　在AI实时数字传感方式下进行无TSA的一步免疫测定。(h) (g)中不同PSA浓度诱导的阳性电机数量。

　　引入单分子结合位点以形成活性微电机的关键。如图5e所示，使用一步单分子免疫反应，每个靶标只能与一个Ab2-MNP

　　尺寸小、磁性弱，在低靶标浓度下无法实现数字方式区分。只有当靶标浓度高于10 pg/mL时，才会出现明显的运动差异。即使使用磁性响应更强的MNPs

　　执行AI-dMIA也能达到类似的传感性能。因此，TSA在保证所提出AI-dMIA的灵敏度方面起着关键作用，无法通过使用大尺寸MNPs来替代。

　　作为微电机载体进行演示。实际上，更小的PS基微电机会表现出更快的运动速度，可能更容易且精确地从阴性纯PS中区分出来。为了验证这一点，研究比较了3 μm PS（PS

　　，每组添加的PSA分子数与相应的PS数量相同。它们与空白对照和PSA处理后的运动轨迹如图所示。空白对照组中电机的轨迹相似，均保持原位布朗运动。相反，靶标诱导的不同尺寸微电机的轨迹显示出明显差异。PS

　　组中，由空白和PSA诱导的轨迹之间的差异也最为显著。这些结果表明，所使用的PS直径越小，获得的结果可能越明显。然而，值得注意的是，直径约500 nm的PS很难使用普通明场显微镜精确监测。因此，在大多数传感场景中，相对较大尺寸的颗粒（如PS

　　）即可满足要求。特别是，通过利用荧光标记的PS和荧光显微镜，亚微米尺寸的荧光PS也可以完美地与AI辅助的MTS结合，实现阳性和阴性电机的精确区分，这在即时数字分析方面展现出巨大潜力。

　　(c) 进行一步夹心免疫反应，以及由空白对照和PSA诱导的轨迹。(d) PS

　　由空白对照和PSA诱导的运动轨迹比较。

　　总而言之，本文提出了一种创新的AI-dMIA，它利用AI辅助的MTS实时追踪微电机运动轨迹，以数字方式超灵敏地量化目标蛋白。在该设计中，微电机受限靶标负载位点上的单分子结合事件可以诱导独特的运动轨迹，并用作阳性信号；强大的MTS能够同时追踪数千个运动轨迹，以实时区分阳性和阴性事件。凭借其独特设计，AI-dMIA不仅表现出优异的传感性能（在灵敏度、时间成本和数字动态范围方面与Simoa相似），而且避免了传统终点数字生物检测所必需的复杂操作、特殊试剂以及高端设备的要求。

　　同时值得指出的是，AI-dMIA在当前阶段也存在一些不足。例如，它依赖明场显微镜来成像和记录微电机运动轨迹，尽管方便且在普通实验室普及，但在通量和小尺寸颗粒（如亚微米颗粒）方面存在局限。此外，该方法中使用的悬浮系统需要与微球的材料和尺寸兼容，且在不同实验环境中校准阈值是不可避免的。因此，研究希望开发标准设备以提高AI-dMIA的通量，并进一步将其与荧光显微镜结合，用于基于一步结合的简单数字检测。如果这些问题能够得到妥善解决，这项提出的AI-dMIA可能为设计微电机数字生物检测开辟新方向，推动痕量生物标志物分析的发展。

　　的制备、AI-dMIA的典型步骤、血清样本中PSA水平的测定、使用PS