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　　栝楼果实（TF）是一种产自中国山东的经典药材。其果皮（栝楼皮，TP）已知具有抗血栓作用。然而，栝楼皮的抗血栓活性成分及作用机制尚未完全阐明。本研究结合斑马鱼模型和高效液相色谱（HPLC），评估了栝楼皮中三种化合物组合的内源性抗血栓作用。首先，我们采用HPLC对栝楼皮水提物中的成分进行了研究。接下来，我们利用斑马鱼模型，通过评估一系列指标来研究这三种化合物组合的抗血栓活性。最后，通过实时定量聚合酶链反应（qPCR）检测相关基因的表达。HPLC在栝楼皮水提物检测到8种成分，其中丹皮酚（Pae）、香叶木素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量较高。O-葡萄糖苷）和5-羟甲基糠醛（5-HMF）。当芍药苷：香叶木素-7-O-葡萄糖苷：5-HMF的比例为4:3:3时，检测到最显著的抗血栓活性。qPCR分析显示，花生四烯酸（AA）诱导的f2、fga、fgb、vwf、ptgs1和tbxas1的异常表达水平得到改善。芍药苷、香叶木素-7-O-葡萄糖苷和5-HMF的组合可能通过抑制炎症反应、凝血级联反应和花生四烯酸代谢途径来减轻AA诱导的血栓形成。

　　心血管疾病（CVDs）已被世界卫生组织列为对人类生命健康的最重要威胁。在中国，约有3.3亿人被诊断出患有心血管疾病，且这一数字仍在持续增长（《中国心血管健康与疾病报告》编写委员会，2022年）。血栓形成是心血管疾病的代表性疾病之一，对人类健康和安全构成严重威胁（Stowell和Stowell，2019年；Chen等人，2020年），而静脉血栓是全球范围内可能导致死亡的重要因素（《柳叶刀·血液学》，2020年）。血栓形成的机制是在静脉或动脉血管中形成血凝块，从而限制血流（Ashorobi等人，2023年）。正常的血流依赖于血浆蛋白、凝血因子、炎症因子、细胞因子、血管内皮等多种因素之间的动态平衡。如果体内平衡失调，血栓形成的概率将显著增加（Ashorobi等人，2023年）。

　　目前，治疗血栓形成主要有两种方法，即溶栓和抗凝，特别是抗血小板聚集。抗凝剂主要用于抑制凝血级联反应中凝血因子的功能（Chapin和Hajjar，2015年；Pant等人，2018年）。在抗血小板聚集中，药物会靶向血小板活化途径，包括血小板受体途径、血栓素途径和蛋白酶激活受体（Depta和Bhatt，2015年）。阿司匹林（ASP）是一种典型的抗血小板聚集药物，它通过环氧化酶（COX）的乙酰化来抑制血小板聚集，从而抑制花生四烯酸（AA）转化为前列腺素G2（PGG2），进而减少血栓素的生成（Lichtenberger等人，2017年；Ornelas等人，2017年），同时特异性清除花生四烯酸（AA）。

　　中医药正越来越普及，能被更多人接触到，并且它既可以用于具有作用温和、副作用少、多靶点高效的特点，可用于预防和治疗血栓（Qu等，2019）。瓜蒌是葫芦科植物栝楼的成熟干燥果实，其果皮、种子和果实均可入药。瓜蒌具有清热化痰、宽胸散结、润燥滑肠的功效（中国药典委员会，2020）。宽胸散结是一种治疗方法，采用温阳散寒、化痰祛湿、活血化瘀、理气等方剂或其他治疗手段，在散结、通阳、宽胸方面发挥着积极作用。活血化瘀、理气是中医治疗血栓的常用方法。

　　中国研究人员报告称，瓜蒌皮（TP）可预防心绞痛、缺氧、缺血再灌注损伤及其他心血管疾病（Gao等人，2015年；Zhu等人，2017年；Zhang等人，2018年）。其他研究表明，瓜蒌皮具有抗血栓作用。此前一项研究显示，给急性心肌缺血大鼠注射瓜蒌皮提取物后，其血浆中的内皮素、血栓素（\(B_{2}(TXB_{2})\)）和心肌丙二醛（MDA）水平显著降低（Zhao等人，2014年）。此外，体外试验表明，注射瓜蒌皮后，花生四烯酸（AA）诱导的血小板聚集和血栓素（\(A_{2}\)，TXA2）的生成受到显著抑制，且这些作用呈剂量依赖性（Ling等人，1988年）。Yang等人记录了690例老年急性缺血性脑病患者的心电图（ECG）和血液流变学参数，发现注射瓜蒌皮后这两项指标均有显著改善（Yang等人，2015年）。此外，体外实验、动物模型体内实验和临床试验均已证实瓜蒌皮具有抗血栓活性，但其发挥抗血栓作用的化合物尚未明确。AA是血小板中\(TXA _{2}\)的前体，随后会转化为\(TXA _{2}\)，这是一种强效的血小板聚集诱导剂。研究表明，AA可直接激活血小板，诱导血小板聚集并形成血栓。AA诱导的血栓被认为同时代表了静脉血栓和动脉血栓（Jagadeeswaran等人，2016年；Zhu等人，2022年）。因此，在本研究中，我们利用AA建立斑马鱼血栓模型，探究TP的活性成分及其作用机制。我们的目的是为未来研究其他药用植物的抗血栓活性及机制提供新的思路和参考依据。

　　TF购自河北大众药业有限公司，其产地为中国山东省。这种果实的中文名称为瓜蒌，是葫芦科植物栝楼（Anguina kirilowii (Maxim.) Kuntze）的成熟干燥果实。TF种植于光照充足、通风良好且无污染的环境中。AA购自北京索莱宝科技有限公司。阿司匹林（ASP）购自美国休斯顿的AbMole BioScience公司。丹皮酚（Pae）、地奥司明-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（地奥司明-7-O-葡萄糖苷）和5-羟甲基糠醛（5HMF）购自四川维克奇生物科技有限公司。二甲基亚砜（DMSO）、乙酸和甲醇购自国药集团化学试剂有限公司。苯硫脲（PTU）、三卡因和邻联茴香胺购自美国Sigma公司。乙腈购自美国俄亥俄州费尔菲尔德的Tedia公司。这些化合物的纯度均大于98%。

　　在本研究中，我们使用了多种仪器，包括配备DP2-BSW图像采集系统的SZX16荧光显微镜（奥林巴斯，日本东京）、HPG-280BX光照培养箱（中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司）、热循环仪（9000型；ABI，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）、荧光定量热循环仪（LC96；罗氏，美国加利福尼亚州南旧金山）、高效液相色谱系统（HPLC，LC-20AD XR，岛津，日本）以及BMG LABTECH酶标仪（SPECTROstar Nano，德国）。

　　斑马鱼凭借其一系列特性，包括较短的发育周期，已成为一种备受推崇的快速药物筛选动物模型。本研究中使用的斑马鱼品系为野生型斑马鱼AB以及转基因斑马鱼\(Tg\)（coro1a:EGFP）和Tg（CD41:EGFP）。繁殖按照已发表的方法进行（Westerfield，2007）。收集斑马鱼胚胎，并在胚胎培养液E3（5 mM氯化钠、0.17 mM氯化钾、0.33 mM \(CaCl_{2}\)和0.33 mM \(MgSO_{4} \cdot 7 H_{2} O )\)）中培养，每天观察胚胎发育情况。6小时后受精后，我们向培养基中添加了3%的丙基硫氧嘧啶（v/v），以防止斑马鱼胚胎产生黑色素。山东省科学院生物研究所（28）批准将斑马鱼用于研究（批准编号：SWS20220323；批准日期：2022年3月23日）。

　　首先，我们选取了高质量的TF，将其分为果皮和种子。然后，将果皮研磨成粉末。接着，取50克果皮粉末与500毫升过滤水混合，加热后通过蒸馏装置回流两次（每次2小时），过滤后合并滤液。之后，对产物进行减压、浓缩和冷冻干燥，得到TP的水提取物。

　　采用岛津LC-20AD XR系统（日本）进行高效液相色谱（HPLC）指纹图谱分析，该系统配备了COSMOSIL HILIC（亲水作用液相色谱）柱（4.6×\((4.6 x\) 250 mm）。以乙腈作为溶剂A，0.2%乙酸溶液作为溶剂B。分析程序如下：0–7分钟，100A%→99A%；7–10分钟，99A%→94A%；10–15分钟，94A%→88A%；15–45分钟，88A%→80A%；45–60分钟，80A%→50A%。进样量为10μL，流速设定为1mL/min，柱温为30°C。同时，在上述相同条件下对标准化合物进行分析，并记录其保留时间。通过比较保留时间，对TP水提取物的成分进行鉴定。

　　为了研究TP中的抗血栓活性物质，我们接下来对TP提取物的三种主要成分进行了研究，这些成分此前已有报道称具有抗炎和抗血小板聚集特性，或者之前在草药中被检测到并被证实具有抗血栓活性（Liu等人，2004年；Xu，2011年；Ye等人，2016年；Xu等人，2021年）。我们选取了三种特定化合物：丹皮酚（pae）、香叶木素-7-O-β \(-D\) -吡喃葡萄糖苷（香叶木素-7-O-葡萄糖苷）和5-羟甲基糠醛（5-HMF）。

　　在单独研究这三种化合物的抗血栓活性时，我们发现这些化合物在斑马鱼中均未表现出显著的抗血栓活性（补充图S1）。此后，我们根据色谱法显示的峰面积，研究了这三种化合物在TP中的原始含量比例所产生的抗血栓效果。在TP提取物中，芍药苷:香叶木素-7-O-葡萄糖苷:5-羟甲基糠醛的比例约为4:3:3。随后，我们专门研究了这三种化合物的抗血栓效果，并对它们的其他比例进行了比较，以确定最佳比例。

　　我们选取了受精后3天（dpf）的健康斑马鱼，将它们转移到24孔板中（每孔5条鱼）。我们设置了对照组、AA组、25μM阿司匹林组和化合物组（1、5、10和20μg/mL）。这些物质均以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂进行混合；暴露实验中DMSO的最大比例为5‰。因此，为消除溶剂对实验结果的影响，空白组中加入了5‰ DMSO作为平衡实验变量。将培养板放入28°C的培养箱中培养6小时。之后，除空白组外，所有实验组均加入AA，直至最终浓度达到80μM（Ma等人，2021；Zhu等人，2022），并培养1.5小时。本实验中，每组包含3个重复孔，每个实验重复3次。

　　将斑马鱼与pae、香叶木素-7-O-葡萄糖苷和5-羟甲基糠醛的混合物共同孵育后，我们使用邻联茴香胺对红细胞进行染色，以观察血栓形成情况（Lin等人，2023年）。首先，我们从培养皿中吸出培养基，并加入1毫升邻联茴香胺染色溶液。然后，将该溶液在暗处孵育15分钟，并用100%二甲基亚砜洗涤染色溶液三次。之后，我们随机选取10条斑马鱼进行立体显微镜观察，并获取相关图像。随后，通过Image-Pro Plus软件对斑马鱼心脏中的红细胞进行分析（包括面积和染色强度）。

　　为了证明化合物组合（4:3:3）具有显著的抗血栓活性，我们接下来按照2.4节所述，通过进行斑马鱼暴露实验来研究TP水提物的抗血栓活性。我们使用了几种浓度的TP水提物（5、10、20和40 μg/mL）。在20 μg/mL浓度下，比较了TP水提物和化合物组合（4:3:3）的抗血栓活性。然后，我们应用一个既定公式（Li等人，2023）计算了TP水提物和化合物组合（4:3:3）的血栓抑制率（TIR），如下所示。 \[TIR=\frac{S_{sample }-S_{model }}{S_{control }-S_{model }} .\]

　　我们从每组中随机选取了10条斑马鱼。这些鱼被麻醉至完全失去活动能力，然后转移到载玻片上。之后，我们使用配备有相机的体视显微镜（奥林巴斯，日本东京）记录每条鱼尾部血管内的血流视频（Parker等人，2014年）。每条斑马鱼拍摄10秒，随后我们使用了Zebra Blood软件（v1.3.2，ViewPoint（法国里昂）来处理视频并确定血流速度。首先，我们校准了血管检测区域，以在评估主要血管时消除来自邻近血管的任何干扰。然后，使用该软件程序检测检测区域内红细胞的运动，从而确定血流速度。该软件检测像素密度的变化，并将这些变化与血管直径相结合，为每一帧生成以纳升/秒（nL/s）为单位的流速（Parker等人，2014年；Zhu等人，2020年）。

　　暴露实验结束后，我们用培养基冲洗斑马鱼。然后，等待斑马鱼在载玻片上稳定下来，再在显微镜下用计数器记录15秒内的心脏收缩次数。这些数据随后被用于确定每分钟的心跳次数（即心率）。

　　利用AA诱导的斑马鱼血栓模型，我们选择了一种巨噬细胞特异性荧光斑马鱼品系\(Tg\)（coola:EGFP）来量化炎症。暴露后，用培养基冲洗斑马鱼，并加入MS222进行麻醉。每组随机选取10条斑马鱼，使用Axio Zoom V16体式绿色荧光立体显微镜（德国蔡司公司）进行检查和图像采集。为了评估斑马鱼的炎症情况，我们对每条斑马鱼的躯干进行了巨噬细胞计数。

　　接下来，我们选择了一种血小板荧光标记的\(Tg\)（CD41:eGFP）斑马鱼品系来研究血小板的循环情况。用pae、香叶木素-7-O-葡萄糖苷和5-羟甲基糠醛的组合处理斑马鱼，用培养基冲洗后进行麻醉。然后，从每组中选取10条斑马鱼，使用SZX16荧光显微镜（奥林巴斯，日本东京）和DP2BSW图像采集系统进行检查和图像采集。手动对每条斑马鱼外周血管中循环血小板的数量进行计数。

　　我们使用了\(TXA _{2}\) ELISA试剂盒（上海朗顿生物科技有限公司），按照制造商的说明，检测实验斑马鱼中\(TXA _{2}\)的浓度（Fang等人，2014；Fei等人，2017）。简而言之，暴露后从每组收集30条斑马鱼。每组的每条鱼首先称重并裂解以获得上清液。然后，我们记录450nm处的光密度（OD），并使用补充材料中描述的方法生成标准曲线。

　　图1 化学成分分析。（A）TP水提物的260 nm紫外色谱图。（1）丹皮酚，（2）5-羟甲基糠醛，（3） Diosmetin-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，（4）腺嘌呤，（5）芹菜苷，（6）2,6-二羟基嘌呤，（7）4-羟基苯甲酸，（8）香草酸。（B）显示这8种化学成分相对比例的饼图。

　　此外，我们使用钙比色测定试剂盒检测了每条斑马鱼中\(Ca^{2+}\)的水平（Cheng等人，2020年；Li等人，2020年）。暴露后，每组共收集30条斑马鱼。首先对每组的每条鱼进行称重并裂解以获得上清液。然后，我们记录了575纳米处的光密度（OD），并使用补充材料中描述的方法绘制了标准曲线。

　　使用总RNA提取试剂盒从30条斑马鱼中提取总RNA。然后，我们使用HiScriptⅡ逆转录酶试剂盒将mRNA转化为单链cDNA。最后，采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix两步法实时定量RT-qPCR技术进行RT-qPCR实验。所有三种试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。以β-肌动蛋白作为内参基因。RT-qPCR结束后，使用LightCycler 96 SW 1.1软件测定每组的CT值。采用\(2-AACT\)方法确定基因的相对表达量（Lin等人，2023）。本部分研究中使用的引物序列详见补充表S1。

　　所有实验均重复三次，所有数据均以平均值±均值标准误（SEM）表示。使用GraphPad Prism 9.0版软件进行数据分析。采用单因素方差分析（ANOVA）（Bartlett检验）来确定各组与AA组之间的显著差异；\(p\) 0.05表示存在显著差异。

　　通过高效液相色谱法在260 nm紫外波长下，从TP水提物中鉴定出8种化合物（图1A）。这8种化合物分别是丹皮酚、5-羟甲基糠醛、香叶木素-7-\(O-\beta\)-D-吡喃葡萄糖苷、腺嘌呤、芹菜苷、2,6-二羟基嘌呤、4-羟基苯甲酸和香草酸。图1B显示了各化合物相对含量的比例。表1提供了这8种化合物的分子量、相对含量和分子式的综合详情。前三名就相对含量而言，这些化合物分别是丹皮酚、香叶木素-7-\(O-\beta\)-D-吡喃葡萄糖苷和5-羟甲基糠醛（比例约为4:3:3）。

　　图2 不同化合物组合比例对斑马鱼血栓形成的影响。（A）TP三种成分的四种不同比例对AA诱导的斑马鱼血栓形成的形态学影响\((n = 10)\)（B–E）直方图显示TP三种成分的四种不同比例对AA诱导的斑马鱼血栓心脏中红细胞面积的统计影响\((n = 10)\)（F）四种不同比例在相同浓度（20μg/mL）下对AA诱导的斑马鱼血栓形成影响的比较\((n = 10)\)（G）不同组合（4:3:3；1:1:1；3:4:3；3:3:4）的血栓抑制率统计分析（\((n=10\)）\(共中央\)与对照组比较\(****p0.0001\)\(***p0.001\)以及\(+*p0.01\)与AA组比较

　　经过AA处理后，实验斑马鱼回流至心脏的血量显著减少（图2A）。这一发现表明AA会诱导血管内形成血栓。当分别添加这四种组合时，我们发现回流至心脏的血量显著增加（图2A）。这表明这四种组合减轻了AA诱导的斑马鱼血栓形成。随着组合浓度的增加，斑马鱼回流至心脏的红细胞面积也显著增加，且呈现浓度依赖性（图2B-E）。最后，我们在20 μg/mL的浓度下，比较了流回心脏的红细胞面积和血栓抑制率。这些结果表明，在所有实验组中，芍药苷:香叶木素-7-O-葡萄糖苷:5-羟甲基糠醛以4:3:3的比例表现出最佳的抗花生四烯酸诱导的血栓作用（图2F和G）。因此，我们在所有后续实验中均采用4:3:3的比例。

　　接下来，我们研究了TP水提取物的抗血栓活性，发现其抗血栓活性浓度为20μg/mL时，TP水提物的效果最为显著（图3C、D）。然而，我们发现当浓度为40μg/mL时，心脏红细胞的染色面积和染色强度均有所下降。这可能是由于TP水提物浓度升高，表现出一定的毒性，但此时其毒性弱于药物，因此在该浓度下仍具有抗血栓功能。另一方面，我们认为TP水提物中其他非活性化合物的浓度已达到一定水平，从而限制了活性物质的效力。因此，在该浓度下，其抗血栓活性相对较弱。为了比较比例为4:3:3的TP水提物组合的抗血栓活性，我们接下来测定了血栓抑制率。分析表明，4:3:3比例组合的血栓抑制率是TP水提物单独使用时的两倍。这表明4:3:3的组合表现出最佳的抗血栓活性。

　　在使用Zebra Blood软件处理视频之前，必须进行校准；校准后帧率的变化随后被用于量化血液流速。血流速度（图4A）。如图4B和图4C所示，经AA处理后，斑马鱼尾部的血流速度显著下降；这表明AA诱导的血栓形成限制了血流的流速。然而，4:3:3的组合显著提高了斑马鱼的血流速度，这表明4:3:3的组合减轻了AA诱导的血栓形成。

　　接下来，我们测定了3日龄斑马鱼的心率，发现用4:3:3组合处理后，丙氨酸诱导的斑马鱼心率降低情况得到改善，且所有浓度都能缓解斑马鱼心率的下降。当组合浓度达到20μg/mL时，观察到其对斑马鱼心率的抑制效果最为显著。

　　巨噬细胞的迁移和聚集是斑马鱼炎症状态的直接指标。AA组的尾部区域出现了最多的巨噬细胞聚集。已知ASP具有抗炎特性，因此ASP组斑马鱼的尾部区域巨噬细胞聚集较少（图5A、B）。此外，用4:3:3的组合孵育后，斑马鱼尾部聚集的巨噬细胞数量减少，且这种效果具有浓度依赖性（图5A、B）。

　　接下来，我们使用Tg（CD41:eGFP）品系的斑马鱼来研究循环血小板。我们发现，AA组斑马鱼的循环血小板数量最少（图6），且体内循环血小板的移动速度比对照组慢，这表明AA组斑马鱼的循环血小板因血栓而大量消耗；此外，血栓的形成导致血小板循环减少。随着4:3:3浓度组合的增加，与AA组斑马鱼相比，循环血小板数量逐渐增多，且血小板移动速度更快（图6）。也就是说，被血栓消耗的斑马鱼循环血小板数量有所减少。这一发现表明，4:3:3的组合能抑制AA诱导的血栓形成，从而使血小板的循环速度加快，被消耗的循环血小板数量减少。

　　血栓形成过程在很大程度上可能依赖于血小板活性和凝血级联反应（Sheng等人，2020年）。首先，我们测量了斑马鱼中\(Ca^{2+}\)的水平。随着4:3:3组合浓度的增加，斑马鱼中\(Ca^{2+}\)的水平逐渐降低（图7G）。接下来，我们通过qPCR研究了与凝血相关的基因表达水平变化以及激活血小板的关键因子。我们发现，随着4:3:3组合浓度的增加，\(f 2\)、fga、\(fgb\)和vwf的表达水平降低（图7A-C、F）。在10μg/mL和20μg/mL的组合浓度下，ptgs1基因的表达相对于AA组下调（图7D）。随着4:3:3组合浓度的增加，tbxas1基因的表达降低（图7E）。最后，我们构建了4:3:3组合治疗AA诱导的血栓形成的潜在机制图（图7H）。

　　在之前的实验中，我们发现4:3:3的组合具有抗炎作用。因此，我们通过qPCR检测了促炎基因的表达水平。结果显示，AA可上调il \(1 \beta\)、肿瘤坏死因子-α（tnf-α）和nf-lb基因的表达水平。经4:3:3组合孵育后，这些基因的表达水平显著下调（图8A–C）。这表明4:3:3组合可能通过肿瘤坏死因子（TNF）等炎症通路发挥作用，从而减轻AA诱导的血栓形成。

　　血管内皮细胞损伤，连同血流速度的改变和凝血系统的变化，都可能引发血栓形成（Cotter和Pillai，2019）。因此，血栓形成的机制较为复杂。然而，中医的科学基础遵循系统治疗原则，多种药物联合使用可以协同作用，从而达到更好的治疗效果。越来越多的证据表明，中药中的多种成分可以作用于多个靶点，调节多种生物学过程，进而发挥一系列药理作用（Xu等人，2021）。中药的多成分效应能够它们还发挥着多种作用机制，包括抗炎和抗氧化作用，从而提高患者的治疗效果并减少不良反应（Wang等人，2018年）。然而，多成分也会带来一些局限性，中药中的其他成分至少在一定程度上会影响活性成分。因此，开展有关中药活性成分中多种成分的发现、富集、作用机制乃至比例的研究具有重要意义。在本研究中，我们探究了TP的抗血栓活性成分，以及它们联合的抗血栓活性和作用机制。

　　根据高效液相色谱（HPLC）结果，我们发现芍药苷、香叶木素-7-O-葡萄糖苷和5-羟甲基糠醛的含量相对较高；许多先前的研究表明，这三种化合物具有抗血栓活性（Liu等，2004；Ye等，2016；Xu等，2021）。起初，我们利用斑马鱼模型研究了这三种化合物各自的抗血栓活性。在浓度低于20μg/mL时，这三种化合物均未表现出显著的抗血栓活性。受中药配伍理论的启发，我们将这三种化合物联合使用，发现它们的组合能发挥显著的抗血栓作用。因此，我们对它们组合后的抗血栓活性及其作用机制进行了研究。

　　斑马鱼模型在血栓研究中有着广泛的应用（Gibbins和Mahaut-Smith，2012年）；这是因为斑马鱼的血小板功能与人类有许多共同特征，包括GPIIb-IIIa、花生四烯酸代谢途径以及众多凝血因子（Jagadeeswaran等人，1999年；Lang等人，2010年）。因此，利用斑马鱼模型研究该组合的抗血栓活性具有重要意义。随后，我们选择AA来建立斑马鱼血栓模型。AA诱导斑马鱼血栓形成是由于在\(TXA _{2}\)合酶的作用下，AA产生\(TXA _{2}\)。这会破坏PGI \(PGl_{2} /\) \(TXA _{2}\)的平衡，导致血小板聚集和血管收缩，最终引发血栓形成（Patrono等人，1984年；Bijak和Saluk-Bijak，2017年）。有研究报道，斑马鱼尾静脉血栓的长度与心脏红细胞面积呈正相关（Qi等人，2017年）。因此，我们选择斑马鱼心脏中的红细胞区域作为血栓形成的指标。当用AA处理斑马鱼后，其心脏中的红细胞区域显著减少，这表明血栓形成的斑马鱼模型已成功建立。此外，测量血流速度也被认为是确定血栓严重程度的一种非常有效的工具（Parker等人，2014年）。在受损血管中，血小板被激活形成血栓，通过多种受体和配体之间复杂的相互作用机制，导致血流速度降低（Estevez和Du，2017年；Yeung等人，2018年）。本研究表明，4:3:3的组合具有明显的抗血栓活性。与TP水提物的活性相比，4:3:3组合的血栓抑制率（TIR）是TP水提物的两倍。此外，在测量斑马鱼的血流速度时，我们发现ASP和4:3:3组合均能抑制血栓形成并提高血流速度。然而，我们还发现，ASP组血流波动图的两个峰值之间的距离大于4:3:3组合组。这一发现表明ASP降低了斑马鱼的心率。这可能会对同时患有血栓和心脏病的患者产生副作用，例如心脑供血不足。而4:3:3组合能够稳定心率，在这方面，4:3:3组合比ASP具有显著优势。

　　血栓形成过程中，炎症反应是不可避免的；这是机体产生的一种保护性反应，旨在清除受损组织和受感染的病原体，并促进组织修复。然而，当炎症反应过度或持续存在时，会释放大量炎症因子，导致内皮细胞功能异常，进而促进血小板活化和内皮细胞损伤，最终加速血栓形成（Nayak和Vedantham，2012；Schroer等，2023）。因此，消除炎症反应对血栓的治疗具有重要意义（Singh和Masuda，2005）。以往的临床研究证实，静脉血栓形成时血清中的炎症因子水平显著升高。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是炎症反应期最早作出应答的炎症因子，它可直接参与炎症反应。在该反应过程中，大量炎症细胞聚集，从而触发包括淋巴细胞和巨噬细胞在内的多种细胞活化（Henke等，2006）。并促进白细胞介素（如IL-1β和IL-10）的释放，这些白细胞介素可作为炎症因子发挥作用（Satoh等人，2015年）。IL-10能够与特异性受体CD210结合，该受体分布于外周血单个核细胞（PBMCs）上，从而激活酪氨酸激酶和Jak激酶，同时还能激活转录因子和信号转导，以抑制NF-κB的激活（Mercurio和Manning，1999年；Sun和Chen，2022年）。因此，TNF-α、IL和NF-κB的高表达水平与血管损伤密切相关。在AA诱导的斑马鱼血栓模型中，我们发现躯干处积聚了大量巨噬细胞，这表明炎症反应的发生。然而，用4:3:3组合处理时，巨噬细胞数量呈剂量依赖性逐渐减少。最后，我们通过qPCR测定了斑马鱼中tnf-α、il-1β和nflb基因的表达水平（图8）。这些基因的表达水平变化趋势与巨噬细胞数量的减少一致。这表明4:3:3组合潜在的抗血栓机制与对tnf-α、il-1β和nflb基因表达的调控有关。

　　血小板和凝血因子在血栓形成过程中发挥着重要作用。正常的内皮细胞通过释放抗凝剂和抑制血小板活化因子来防止血栓形成（Mason等人，1977年；Mehta和Malik，2006年）。当内皮细胞受损时，血小板被激活并释放大量活性因子，如ADP、\(TXA _{2}\)和\(Ca^{2+}\)，随后导致血小板聚集（Warner等人，2011年；Wijeyeratne和Heptinstall，2011年）。一系列凝血反应可通过凝血级联反应诱发血栓形成（Zhou等人，2017年）。最早的反应涉及血管性血友病因子（vWF），它是一种必需的黏多糖蛋白，当血管受损时，由白细胞释放到血液中，并与血小板上的GPIb蛋白受体结合，形成松散的栓子，最终导致血栓形成（Gragnano等人，2017年；Shahidi，2017年）。此外，fga、fgb和fgg基因编码纤维蛋白原，在凝血级联反应中起关键作用（Vo等人，2013年）。纤维蛋白原能特异性结合血小板糖蛋白IIbIIIa，引起血小板聚集（Farrell等人，1992年；Ma等人，2021年）。而且，纤维蛋白原（Fga、Fgb和Fgg）和凝血酶（F2）水平升高，从而诱发高凝状态和血栓形成（Chopard等人，2020年）。在此，我们证明4:3:3的组合可以抑制血栓形成并减少循环血小板的消耗（图6）。此外，qPCR结果显示，4:3:3的组合显著提高了血小板活化因子（vwf）和其他多种参与凝血级联反应的因子（fga、fgb和\(f 2\)）的基因表达水平。这些数据表明，4:3:3的组合可能通过抑制凝血级联反应和血小板活化来抑制血栓形成。

　　前列腺素-内过氧化物合酶（PTGS和COX）以及\(TXA _{2}\)合成酶是AA通路早期阶段的关键蛋白质。PTGS是一组能够将AA转化为类花生酸的酶，类花生酸是活性代谢物，包括前列腺素和血栓素（Sheng等人，2020年）。PTGS有两种同工型，即PTGS1（COX1）和PTGS2（COX2），其中更主要的形式是PTGS1（Grosser等人，2002年）。研究表明，低剂量APS可使PTGS1永久乙酰化，阻止AA转化，并抑制血栓形成（Baigent和Patrono，2003年）。此外，PTGS1将AA转化为PGG2，其化学性质不稳定，可水解形成前列腺素H2（PGH2），随后在\(TXA _{2}\)合酶的作用下转化为\(TXA _{2}\)，这是一种血小板激动剂和血管收缩剂（Smith和Malkowski，2019；Badimon等人，2021）。AA代谢途径中的这两个步骤是血栓形成的关键枢纽。然而，在我们的血栓模型中，AA对tbxas1的表达水平有显著影响，但对ptgs1的表达水平无显著影响。不过，我们认为AA可能在转录后水平调控PTGS1的蛋白活性，尽管这一假设还需要进一步研究。在本研究中，我们通过qPCR检测了ptgs1和tbxas1的表达水平，发现较高浓度的4:3:3组合可抑制它们的表达。基于这些结果，我们认为4:3:3组合可能通过抑制ptgs1和tbxas1的表达水平来降低\(TXA _{2}\)的水平，改善前列腺素I（PGI）\(PGl_{2} / TXA_{2}\)的平衡，抑制血小板活化和凝血级联反应，从而抑制血栓形成。因此，4:3:3组合的抗血栓作用可能也与AA代谢途径密切相关。

　　TF作为一种药食同源植物，在预防心血管疾病方面发挥着重要作用。本研究探讨了TP中三种成分组合的抗血栓活性及其潜在作用机制。我们的分析表明，该组合可能通过对凝血级联反应、炎症反应通路和花生四烯酸代谢通路产生影响来抑制血栓形成。未来的研究应探讨这两种化合物联合使用的抗血栓效果。这不仅可以降低后续制药过程中的成本，还能为今后研究其他中药的疗效提供参考依据。

　　苏州木芮生物科技有限公司（以下简称“木芮生物”）成立于2018年1月22日，是一家致力于以斑马鱼为模式生物提供生物医学基础科研服务、斑马鱼实验操作试剂盒、斑马鱼临床疾病模型、其他生物学实验试剂以及进行斑马鱼应用技术转化的高科技公司。

　　木芮生物以斑马鱼为模式生物，建立起了上百种的临床疾病模型，深入探索相关疾病发生的深层次疾病机制， 进而为临床治疗疾病提供可行的治疗方案或者药物筛选机制。到目前为止，木芮生物已经建立起包括遗传、行为、 细胞、 生化分子等斑马鱼相关成熟的技术，并且依托这些技术成功将斑马鱼应用到基础科研、毒理测试、癌症药物筛选、 中药药效成分筛选、保健品开发和功效评价。

　　木芮生物经过七年的快速发展，公司现已有核心创业团队成员20余人，其中博士研究生1人，硕士研究生6人，本科生10余人。木芮生物成立后，陆续与江苏省产业研究院和苏州纳米应用技术研究所等科研单位建立起了科研合作，建立了“模式生物技术与应用研发中心”；公司于2020年被认定为“国家高新技术企业”，于 2021年底获得苏州工业园区“领军成长企业”称号。